Bio-Rad微滴式数字PCR新型冠状病毒检测方案伯乐Bio-Rad
Bio-Rad微滴式数字PCR技术（ddPCR）是第三代PCR技术，无需标准参照物质即可给出样本的拷贝数浓度而非Ct值，其检测结果为判读提供量化的依据。根据LOB(limit of blank)和未知样本的定量结果作出判读，可避免人为错误，缩小灰区，提高检出率。
ddPCR独有的微滴处理技术，使其对PCR扩增效率的变化不再敏感，不惧含有PCR抑制物样本的挑战。随着疫情的变化以及流行病学调研的推进，更多类型的检测乃至环境监测也可能需要进行，ddPCR的这一优势会发挥作用。此外，如果新型冠状病毒发生变异，病毒基因序列上引物、探针靶向位置出现SNV，ddPCR亦能克服引物、探针结合能力下降带来的扩增效率变化，确保稳定检出。不仅如此，还能根据样本微滴荧光信号的变化，发现引物探针靶标区域可能出现变异的病例，为NGS测序分析病毒变异提供样本，助力流行病学研究。
应用如下
2019- nCoV病毒检测方法
疑似病人的快速取样和检测是防止疫情扩散的当务之急。目前新型冠状病毒的诊断，是在符合疑似病例标准的基础上，对痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等样本进行荧光定量PCR（RT-qPCR）检测。中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所推荐选用针对新型冠状病毒的开放读码框1ab（open reading frame, ORF1ab）、核壳蛋白（nucleoprotein，N）基因区域的引物和探针序列：
Target 1（ORF1ab）:
正向引物（F）：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物（R）：ACGATTGTGCATCAGCTGA
荧光探针（P）：5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
Target 2（N）:
正向引物（F）：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
反向引物（R）：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
荧光探针（P）：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-BHQ1-3'
在荧光定量PCR上的结果判断：
阴性:无Ct值或Ct为40；
阳性：Ct值<37，可报告为阳性；
可疑：Ct值在37-40之间，建议重复实验，若重做结果Ct值<40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性,否则为阴性。
数字PCR实验，建议采用官方机构推荐的引物、探针序列，结合Bio-Rad ddPCR RNA一步法预混液，经优化反应条件后使用。实验步骤如下图：
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