蛋白质提纯的注意事项和常见问题有什么?

2023-12-10

在进行任何一种蛋白质纯化的时候,都要时刻注意维护它的稳定性,保护它的活性,那么你知道蛋白质提纯的注意事项和常见问题有什么吗?让我们一起来看看吧!

一、注意事项:

1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。

2、浓度不要太稀,蛋白浓度维持在μg/mL~mg/mL。

3、选择合适的pH,除非是进行聚焦层析,所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同,防止蛋白质的沉淀。

4、使用蛋白酶抑制剂,防止蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时,加入DNA酶,降解DNA,防止DNA对蛋白的污染。

5、避免样品反复冻融和剧烈搅动,以防蛋白质的变性。

6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。

7、在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/LDTT(二硫苏糖醇)(或β-巯基乙醇),防止蛋白质的氧化。

8、加1~10mmol/LEDTA金属螯合剂,防止重金属对目标蛋白的破坏。

9、使用灭菌溶液,防止微生物生长。

二、常见问题:

1、通过 His 标签纯化的蛋白,杂带比较多,如何改进?

(1)如果纯化的是上清,蛋白酶会部分降解目的蛋白,可通过加多种蛋白酶抑制剂改进。

(2)可提高杂蛋白与镍柱结合起始咪唑浓度,以降低杂蛋白与镍柱的亲和力。

(3)杂蛋白和目的蛋白结合,可通过超声前加入去垢剂的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。

2、镍柱使用中出现棕色的原因

(1)柱子发生堵塞,可能是样品中细胞碎片或其他杂颗粒所致,所以样品一定要高速离心,并过0.22或者0.45的膜。

(2)上清纯化时,蛋白发生变性,有絮状物产生,赶紧加入 1-2mM DTT (上清样品处理要在冰浴中进行),还不行加尿素变性,使其在变形环境下。

(3)样品处理时的料液比不要太小,否则黏度大,或者导致蛋白析出或变性,料液比要在 1/10-1/15 之间较适宜。

3、纯化过程中蛋白出现了浑浊应如何处理?

(1)出现浑浊,说明蛋白处在不稳定的环境中或者自身就不稳定,所以要检查缓冲体系是否正确,环境是否低温,或在缓冲液中加入还原剂 DTT。

(2)加入肌氨酸钠,迅速使蛋白变性,消除浑浊现象。

更多有关蛋白质提纯的注意事项和常见问题,请联系金山科研平台:微信jinshanbio

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