RNA提取的操作关键点在哪?

2023-12-10

RNA是目前发现细胞内生物功能zui丰富多样的生物大分子,同时是DNA与蛋白质信息传递的桥梁,因此完整RNA的提取和纯化是功能基因组时代的重要手段。那么你知道RNA提取的关键点在哪吗?让我们一起来看看吧!

所有RNA的提取过程中都有五个关键:①样品细胞或组织的有效破碎;②有效地使核蛋白复合体变性解离,释放出RNA;③对RNA酶的有效抑制;④有效地将RNA从DNA和蛋白质混合物中分离;⑤对于多糖含量高的样品还要采取措施有效去除多糖杂质。但其中最关键的是抑制RNA酶的活性。

RNA酶(RNase),尤其是胰RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类。除细胞内RNase以外,环境中灰尘、各种试验器皿和试剂、人体的汁液以及唾液中均存在RNase。这类酶耐热、耐酸、耐碱,如煮沸也不能使之wan全失活,蛋白质变性剂可使之暂时失活,但变性剂去除后,又可恢复活性。RNase 的活性不需要辅助因子,二价金属离子螯合剂对它的活性无任何影响,故在提取RNA时,应尽力减少RNA酶对RNA的降解作用。

创造一个无RNase的环境主要包括两个方面的工作,即极力避免外源RNase的污染和尽力抑制内源性RNase的活力。前者主要来源于操作者的手、实验的器皿和试剂;后者主要来源于样品的组织细胞。RNA提取应在洁净的环境中进行,戴口罩和手套操作,使用一次性无菌器具,玻璃器皿用0.1%二乙基焦碳酸盐(diethyl procarbonate, DEPC) 按规定消毒,所用试剂也应经专门的消毒灭酶处理。内源RNA酶则采用加入抑制剂及向提取液中加入可使所有蛋白质变性的试剂:如异硫氰酸胍(GTC) 和F巯基乙醇,盐酸胍,尿素,去污剂(十二烷酰肌氨酸钠、SDS),酚/氯仿,整个提取操作都在冰浴下(0~4℃) 操作。

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