DNA质粒提取的原理是什么?

2023-12-10

在没有质粒提取试剂盒之前,大多提取质粒都是自己配置试剂来提取大肠杆菌中的质粒。现在的试剂盒只是改了一个名字而已,试剂还是那几个试剂。用的原理还是那个原理:碱裂解法从大肠杆菌制备质粒,是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。那么你知道DNA质粒提取的原理是什么吗?让我们一起来看看吧!

一、为什么用无水乙醇沉淀DNA?

用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇不与核酸起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易亍聚合。一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格比95%乙醇昂贵)。但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙醇,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。

二、在用乙醇沉淀DNA时,为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1~0.25mol/L?

在pH为8左右的溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不wan全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好。在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀。

三、加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与KAc来处理?

加进去的RNase本身是一种蛋白质,为了纯化DNA,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加KAc使这些复合物转发为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加wan全。也可用饱和酚、氯仺抽提再沉淀,去除RNase。在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到较好效果。

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