PCR作为分子生物学中常用的技术之一，目的是通过引物的作用扩增DNA序列。那PCR引物设计的时候，应该注意哪些问题呢？

一、引物设计区域：最好在模板cDNA的保守区内

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。

二、引物设计长度：15~30bp最you

引物长度(primer length)常用的是18~27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

三、引物GC含量：40%~60%，Tm值≈72℃。

GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

四、引物3'端：避开密码子的第3位

如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

五、引物3'端：不能选择A,最好选择T

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。

六、碱基分布：随机分布

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3′端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发(False priming)。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3'端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

七、引物自身及引物之间不应存在互补序列

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3'端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Cross dimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高(应小于4.5kcal/mol)。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

八、引物5'端和中间△G值应该相对较高，而3'端△G值较低

△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5'端和中间△G值相对较高，而3'端△G值较低(绝对值不超过9)的引物。引物3'端的AG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 (不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析)

九、引物的5'端可以修饰，而3'端不可修饰

引物的5'端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5'端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地gao辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。3'端也不能有形成任何二级结构可能。

十、扩增产物的单链不能形成二级结构

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件(比如RNAstructure)可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能(△G°)小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2'-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

十一、引物应具有特异性

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR,因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。做Real Time时，用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

(1)避免重复碱基，尤其是G。

(2) Tm=58-60度。

(3)GC=30-80%。

(4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C。

(5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

(6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp最为合适(可以延长至300 bp)。

(7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

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