相关介绍:细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独te的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以采用Annexin V与PI双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。

储存条件:2-8℃避光保存,勿冰冻。

有 效 期：一年

注意事项:本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。此产品仅供研究，不用于临床诊断。

操作步骤：

细胞样品的准备：

a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完quan离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

b)对于悬浮细胞：1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完quan离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

用去离子水按1:3稀释结合缓冲液(4ml 4x结合缓冲液+12ml去离子水)；

用1x结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1-5×106/ml；

取100µl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5µl Annexin V/FITC混匀后于室温避光孵育5分钟；

加入10µl 20ug/ml的碘化丙锭溶液(PI)，并加400µl PBS，立刻进行流式检测。

实验设计：

空白管：阴性对照组细胞，不加Annexin V/FITC，碘化丙锭溶液(PI)。用于调节电压单染管：阳性对照组细胞，只加Annexin V/FITC。用于调节补偿

检测管：处理的细胞，加 Annexin V/FITC，碘化丙锭溶液(PI)。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

样本分析：

1. 流式细胞仪分析：FITC 的最大激发波长是 488nm，最大发射波长是 525nm，建议选择FL1 通道检测；PI-DNA复合物的最大激发波长是 535nm，最大发射波长为 615nm，PI 的红色荧光在 FL2 或 FL3 通道检测。用FlowJo等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），FITC 为横坐标，PI 为纵坐标。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡或坏死的细胞有绿色和红色荧光双重染色。

2. 荧光显微镜观察：

a)滴一滴用 Annexin V-FITC/PI 双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。

b)在荧光显微镜下用双色滤光片观察。Annexin V-FITC 荧光信号呈绿色，PI 荧光信号呈红色。

【注】：对于贴壁细胞，可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。

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